●文献解析|Science—体外培养食蟹猴胚胎发育图谱

理解包括人类在内的灵长类动物胚胎发育机制，一直是生命科学领域的核心问题之一【1】。其中，原肠运动是灵长类胚胎着床后发育的重要生物学事件【2】。

体外受精后7-20天内，体外培养食蟹猴胚胎发育图解【3】。其中，TE滋养外胚层，AMEC是羊膜上皮细胞，ICM/EPI是内细胞团/上胚层，PGC是原始生殖细胞，PE/VE/YE是原始内胚层/脏内胚层/卵黄囊内胚层，GAS是原肠运动阶段细胞，EXMC是胚外间质细胞。

鼠科动物的研究揭示了调控原肠运动的分子机制【4-9】。然而，老鼠和人类间存在许多解剖、生理以及发育上的差异，来源于老鼠的认识难以完全应用到人类胚胎研究中【10-12】。

前人已经在体外观察到了人类胚胎发育早期出现的上胚层扩张、谱系分离以及羊膜和卵黄囊形成【13、14】。但由于取材困难及伦理规范等原因(如14天原则)，难以完整研究人类胚胎发育过程。

因此，对近缘种进行研究，揭示不同灵长类动物早期胚胎发育阶段的保守机制并将其应用到人类胚胎研究中，或是更为可行的研究手段【2】。非人类灵长类动物中，猴子与我们人类的亲缘关系最近，这意味着猴子是最好的替代物种。

虽然已经使用体外培育的食蟹猴胚胎研究了几个灵长类着床后事件，但关键问题仍未得到解决【1】。

为此，昆明理工大学灵长类转化医学研究院季维智教授、谭韬教授、牛昱宇教授与Salk研究所Juan Carlos Izpisua Belmonte教授合作，结合体外胚胎培养系统和单细胞多组学测序技术对体外培养的食蟹猴胚胎进行研究，详细揭示了食蟹猴发育早期分子水平变化。

该研究成果发表于2019年Science。

影响因子：41.037

第一作者：昆明理工大学灵长类转化医学研究院牛昱宇教授、谭韬课题组博士生孙念琴、硕士生李昌、华大基因雷莹博士。

通讯作者：Salk研究所的Juan Carlos Izpisua Belmonte教授、昆明理工大学灵长类转化医学研究院牛昱宇教授、季维智教授和谭韬教授。

开放获取数据：所有测序数据保存于NCBI，编码SRP175059；以及CNSA，编码CNP0000231。

研究者使用免疫荧光(IF)技术，分析IVC(体外培养)食蟹猴胚胎中上胚层(OCT4、NANOG)、下胚层(GATA6)及滋养层(CDX2)谱系特异性标记的表达(图1A、B)，证实了食蟹猴胚胎能在体外培养条件下进行胚胎及胚外谱系分化。

图1 IVC猴胚胎的荧光免疫染色成像结果【3】。其中，A、B图分别是IVC第8天及第9天猴胚胎中，OCT4、GATA6、CDX2及DAPI的IF成像结果，▲指向内细胞团中表达GATA6/OCT4的细胞，箭头指向滋养外胚层中表达CDX2/OCT4的细胞。此外，每个图中的下图是上图中黄色点框住部分的放大结果。

研究者对IVC食蟹猴胚胎中NANOG(EPI细胞)、FOXA1(VE/YE细胞)及COL6A1(胚外间质细胞，EXMCs)的表达进行IF分析【15-17】，发现IVC食蟹猴胚胎能形成羊膜及卵黄囊腔(图2)。

图2 IVC食蟹猴胚胎羊膜和卵黄囊腔的荧光免疫染色成像结果【3】。图中黄色点线框住区域为上胚层，白色点线框住区域为卵黄囊，▲指向EXMC。

由于伦理规范的限制，导致学者们对人类胚胎原条(PS)感应的认识较为缺乏。

而体外培养到20天的食蟹猴胚胎IF分析结果证实其存在PS形成过程(图3B)，这使得研究者得以对PS感应进行研究。

scRNA-seq数据分析结果显示，IVC食蟹猴胚胎中原肠运动阶段细胞高表达WNT3等WNT信号通路基因(图5C)及WNT通路阻遏蛋白CER1【18、19】。scATAC-seq分析揭示原肠运动阶段细胞WNT信号家族成员的基因调控区域处于染色质开放区(图5D)。

这些结果表明原肠感应期间WNT信号起到了重要作用。

图3 IVC食蟹猴胚胎中PS的发育【3】。图A是IVC第14天和第17天胚胎的荧光免疫染色成像结果，白色点线框住区域为EPI，▲指向OTX2+原肠运动阶段细胞；图B是EPI和Gast中部分WNT信号家族成员表达水平小提琴图；图C是WNT信号家族部分基因的调控区域可及性，EPI是上胚层，PE是原始内胚层，TE是滋养外胚层，EXMC是胚外间质细胞，Gast是原肠运动阶段细胞。

研究者在体外培养13-17天内的食蟹猴胚胎羊膜细胞及羊膜和EPI(上胚层)的连接区域处检测到了两个灵长类动物特异性PGC(原始胚胎干细胞)标记的表达(图4A)，表明IVC食蟹猴胚胎羊膜中可能存在PGCLCs(原始胚胎干细胞样细胞)。该结果也得到scRNA-seq数据的支持(图4B)。

人类胚胎干细胞的PGCLC分化需要转录因子EOMES【20、21】，但只在体外培养食蟹猴胚胎的部分原肠运动阶段细胞中检测到EOMES/SOX17的表达，这些细胞可能是定形内胚层的祖细胞(图4C)，

这一结果支持了在体内，羊膜是PGC的来源【22】。

图4 IVC食蟹猴胚胎羊膜的荧光免疫染色成像结果【3】。A图中箭头指的是羊膜内PGCLCs，▲指的是EPI下的PGCLCs，☆指的是SOX17-/TFAP2C-细胞；B图是PGCLCs聚群中，PGC标志基因表达水平小提琴图；C图中箭头指向SOX17+EOMES+细胞，▲指向TFAP2C+SOX17+细胞。

为了研究IVC食蟹猴胚胎的谱系分化，研究者使用scRNA-seq和scATAC-seq分析了7个发育阶段(第9、11、13、15、17、19、20天)单细胞的转录组(着床前1,014个细胞，着床后1,198个细胞)，发现：

scRNA-seq数据分析结果显示，IVC胚胎中存在4个细胞聚群，且这些聚群与其对应的体内胚胎细胞聚群相关联(图8A、B)【15】，体内猴胚胎的Geo-seq数据分析结果也证实了这一点(图5 C)；

scATAC-seq数据分析结果显示，IVC胚胎中存在6个细胞聚群(还包括2个原肠运动阶段细胞聚群)，与scRNA-seq数据分析结果相似(图5 D)；

图5 IVC食蟹猴胚胎的转录图谱【3】。A图是7个不同发育时间点IVC猴胚胎的t-SNE降维聚类结果；B图是体内及IVC猴胚胎细胞的t-SNE降维聚类结果；C图是3个不同发育时间点体内猴胚胎样本Geo-seq数据，及7个不同发育时间点IVC猴胚胎样本scRNA-seq数据的t-SNE降维聚类结果；D图是scATAC-seq数据的t-SNE降维聚类分析结果。EPI，上胚层；PE，原始内胚层；EXMC，胚外间质细胞；TE，滋养外胚层；VE/YE，脏内胚层/卵黄囊内胚层；Gast，原肠运动阶段细胞；ICM，内细胞团；paTE，壁滋养外胚层；pre，着床前；post，着床后；preE，着床前早期；preL，着床前晚期；postE，着床后早期；postL，着床后晚期。

TE(滋养外胚层)转录组从第9天到第20天发生连续变化，表明TE细胞发生逐步分化(图6A)；

伪时间分析结果显示，TE细胞从IVC第11天开始存在2种类型，一种高表达TCEAL4的可能是细胞滋养层(CTs)，一种高表达GCM1的可能是合胞体滋养层(STs)【13、23】(图6B)。

图6 TE细胞聚群的t-SNE降维聚类分析结果(A)和伪时间轨迹分析结果(B)【3】。

PE(原始内胚层)细胞具有2个分别高表达APOA2和CXCR4的细胞聚群，表明可能存在VE/YE分化(脏内胚层/卵黄囊内胚层)(图7A)；

两个PE细胞聚群的富集分析结果显示，聚群1富集了参与脂质代谢和转运的基因，聚群2富集了介导转录和蛋白质合成的基因(图7B)。

图7 PE细胞聚群的t-SNE降维聚类分析结果和两种类型PE细胞的标志基因(A)，以及不同类型PE细胞的富集分析结果(B)【3】。

EXMCs(胚外间质细胞)聚群富集了参与胞外基质和EMT通路的基因，同时，高表达调控EMT(上皮-间质转换)的TGFβ信号家族成员(图8A、B)，表明PE细胞经EMT后分化成为EXMCs，这一过程可能受TGFβ信号通路的调控【15,16】。

图8 EXMCs中差异表达基因的富集分析结果(A)及TGFβ家族成员表达水平小提琴图(B)【3】。

当前对灵长类动物胚胎着床后羊膜上皮细胞的认识较少【24、25】。为此，研究者分析了IVC食蟹猴胚胎scRNA-seq数据中的羊膜上皮细胞，发现：

羊膜上皮细胞转录组谱与EXMC相似(图9 A)，表明这两种类型细胞可能在发育上具有联系；

富集分析结果显示羊膜上皮细胞中富集了TGFβ信号(图9 B)。

图9 EPI、PE(VE/YE)、TE、AM及EXMC细胞间相关系数热图(A)和羊膜上皮细胞的GO富集分析结果(B)【3】。

研究者还分析了EPI细胞聚群在胚胎着床前后发生的多能性转变，发现：

原始多能性相关基因在早期EPI细胞中高表达，而初始多能态特异性基因在晚期EPI细胞中表达水平逐渐增加(图10 B)；

EPI-A聚群中富集了参与氧化磷酸化和线粒体呼吸的基因，EPI-B和EPI-C中富集的基因与核糖体生物合成和翻译有关，Gast中参与胚胎形态发生的基因表达上调但没有富集到线粒体氧化代谢相关基因图10 C)。

这些结果表明，原始态EPI细胞表现出氧化磷酸化代谢模式，与前人对PSCs的研究结果相一致【26、27】。

图10 A图是不同EPI细胞谱系中原始/初始多能性标记基因的表达热图；B图是不同类型EPI细胞的GO富集分析结果【3】。

为了研究可能参与谱系分化的信号通路，研究者对典型信号通路进行研究，发现EXMC和PE(VE/YE)通过配基频繁的与其他细胞类型相互作用，EPI细胞主要表达的受体能接受来自PE(VE/YE)、EXMC和TE的配基(图11)。

图11 IVC猴胚胎不同谱系间可能的受体-配基联系(B)【3】。

IVC食蟹猴胚胎中的PGCLCs可能来源于羊膜(图4)，为了研究PGCLCs分化背后可能的转录机制，研究者对可能的PGCLCs与EPI细胞scRNA-seq数据进行分析，发现：

PGCLCs存在两种类型，一种与EPI细胞聚集(PGCLC-EPI)，一种不与EPI细胞聚集(PGCLC)(图16 A)；

富集分析结果显示PGCLC-EPI细胞聚群中富集了参与核糖体生物合成的基因，而PGCLC细胞聚群中富集与成纤维细胞生长因子和细胞-细胞WNT信号响应有关的基因(图12 B)。

PGCLCs和EPI间的部分差异表达基因，在PGCLCs富集分析结果中属于细胞基质粘附和胞外结构组织(图12 C)，表明了PGCs的迁移特性，这与体内食蟹猴PGCs中EMT相关基因的表达一致【22】；

IVC猴胚胎的PGCLCs与体内早期PGCs的转录组相似，说明两者的关系紧密(图12 D)。

图12 PGCLCs的转录信号【3】。A图是PGCLCs和EPI细胞的伪时间发育轨迹(左)和轨迹上细胞的来源(右)；B图是PGCLC-EPI和PGCLC细胞聚群间差异表达基因的GO富集分析结果；C图是PGCLCs和EPI细胞间差异表达基因的GO富集分析结果；D是PGCLCs与原始胚胎干细胞间的相关系数热图。EPI，上胚层；PGC，原始胚胎干细胞；PGCLC，原始胚胎干细胞样细胞；ePGC，早期PGC；IPGC，晚期PGC；f，雌性；m，雄性。

体内体外微环境的不同可能引起了体外培养胚胎的结构差异，特别是羊膜和卵黄囊腔。

体外培养的食蟹猴胚胎中，原始内胚层细胞受TGFβ信号调控，经EMT分化成可能的脏内胚层/卵黄囊内胚层，以及胚外间质细胞，这与小鼠胚胎的原始内胚层分化过程不同，需要进一步研究。

研究结果支持体内的原始胚胎干细胞是来源于羊膜的【22】。

体外培养食蟹猴胚胎中，部分原始胚胎干细胞样细胞转录组与上胚层细胞相似，表明这些细胞也可能来源于上胚层。

“我们的研究首次看到了早期发育这一黑箱的内部，”Salk基因表达实验室教授，文章共同通讯作者Juan Carlos lzpisua Belmonte教授说道。“现在，我们能观察到胚胎发育每个阶段中细胞是如何变化的，它们需要产生哪些因子，哪种因子将帮助产生不同的细胞和组织。”

“为了理解灵长类动物原肠运动背后的细胞和分子机制，3年前我们就开始在国内培养猴胚胎。我们的团队在非人类灵长类动物的系统研究中积累了长期经验，拥有完善的可重复性研究系统，得益于这样一个平台，我们才能实现目标。”季维智教授，中国昆明理工大学灵长类转化医学研究中心院长以及共同通讯作者说到。

为了更好的研究原肠运动过程，研究者优化了人类胚胎培育protocol，使早期灵长类动物胚胎在实验室条件下能发育20天之久。而以前的研究者只能培养灵长类动物胚胎到孕后第二周前。

该团队发现培养的胚胎细胞表现出明显的、原肠胚胚层的发育轨迹，揭示了这一发育过程中的分子细节。该数据能帮助更好的研究干细胞分化。

“这些结果解释了一些灵长类发育过程中关键的调控网络以及信号通路，”Izpisua Belmonte说到。“该系统为在实验室中检测灵长类动物健康及不健康的早期发育阶段提供了基础和资源。”

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参考文献

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2.(2019). "谭韬、牛昱宇及季维智课题组Science发表灵长类胚胎发育最新研究成果"

http://www.lpbr.cn/blog/science.

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